脂质组学

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脂质组学
脂质组学
脂质组学 2023-05-17

概述

脂质组学,系统研究细胞、组织或生物体内所有脂质的学科。主要研究数千种脂质的类型、分布、功能、与其他生物分子的相互作用,以及它们在生理代谢、病理状态时的动态变化。涉及的分析技术包括脂质的提取、分离、液相层析、各种质谱、核磁共振波谱、荧光光谱等。对深入研究各种脂质在生物膜结构、能量转换、信号转导等方面有重要意义,同时在临床检验、疾病诊断领域也有应用价值。然后利用反相色谱将组分中的脂质分子(molecular species)进一步分离,进而利用质谱进行定性、定量分析。“鸟枪法”技术策略通常采用ESI-LC-MS/MS,即根据脂质分子在不同pH 值条件下带电倾向的差异,通过调整样品的pH值,改变脂质分子的离子化倾向,并结合ESI正、负离子检测模式的切换,达到离子化过程中分开检测不同脂质分子的目的,最后利用串联质谱技术进行分析鉴定和定量。
 

1 代谢物检测

样品内代谢物经过提取后进入高分辨率质谱仪,在质谱仪的正负离子模式下进行检测,产生大量的质谱数据。本分析首先利用XCMS软件进行峰提取。XCMS软件根据代谢物一级荷质比(m/z)和保留时间共同确定特定物质,并提取该物质的一级色谱峰面积作为定量信息。利用代谢物一级m/z和二级碎片离子m/z与数据库里标准品匹配进行代谢物鉴定。


1.1 质谱峰提取及鉴定

质谱下机原始数据主要作以下处理:

1)数据转换。经过官方软件MSConvert软件转换成mzXML格式

2)离子峰提取。导入R软件包XCMS进行峰提取,获得代谢物离子峰的质荷比、保留时间和离子面积等信息。XCMS的工作流程主要包括以下几个步骤:峰对齐,峰提取以及峰面积计算等。

最后得到的离子统计信息如下:
 

1.2 质谱峰提取质控

每个物质在质谱的表现是拥有唯一的质荷比和色谱保留时间。对XCMS软件提取的物质进行质控,主要包括:
1)利用总离子流图TIC(total ion chromotogram)整体的把控样品整体质谱信号强度;

2)每个物质的离子色谱图XIC(extracted ion chromotogram);

图片说明:提取离子色谱图(XIC,extracted ion chromotogram)。每一条线为该代谢物的色谱图,保留时间为横坐标,强度为纵坐标,不同颜色表示不用的样品。
 

1.3 代谢物注释

对XCMS检测到的物质,我们首先利用开源软件metaX通过物质的一级m/z与HMDB、KEGG进行匹配。 数据库里的代谢物进行匹配,得到一级鉴定结果。由于数据库里存在很多同分异构体的代谢物,一级鉴定结果往往有很多一个m/z对应多个代谢物的情况。本分析利用参考代谢物二级质谱图谱库,与样品的代谢物二级质谱数据进行匹配,得到可信度更高的代谢物鉴定结果。对所有检测到的feature进行代谢物鉴定,每个物质在质谱仪里面可以进行碎裂,这些碎片可以通过质谱检测生成二级质谱图,与公共数据库的标准品的二级质谱图进行匹配,打分,最终得到代谢物二级鉴定结果。

图片说明:二级质谱匹配图。该图表示某一二级鉴定代谢物的二级匹配情况,横坐标为代谢物分子量,纵坐标上部分为实验图谱,下部分为标准品图谱。

 对二级鉴定代谢物的种类进行宏观评估。

图片说明:二级鉴定代谢物种类统计图。该图提取物质所在物质分类信息并进行数目的统计,横坐标为分类,纵坐标为代谢峰数。   
         

2 代谢物定量

代谢物的定量信息来自于物质一级色谱峰面积(示例图)。本分析利用XCMS软件对每个物质在每个样品的强度信息提取,随后对提取出来的数据使用metaX软件进行质控,首先去低质量峰(将QC样本中缺失超过50%,或者实际样本中缺失超过80%的离子去除),随后利用KNN(K-Nearest Neighbors)方法进行缺失值填充,即将所有QC样品中变异系数(CV)> 50%的离子过滤掉(CV > 50%的离子在实验过程中波动较大,并不做差异定量分析)。代谢物经过数据过滤,在每个样品的归一化强度数据路径如下,该部分数据已经进行归一化。研究者可以用公共的数据分析平台进行个性化分析,如MetaboAnalysis,metaX,这些平台可以调整参数重新分析数据,如单变量分析:比值分析、T检验、Wilcoxon检验、ROC,多变量分析:PCA、PLS-DA等。

2.1 代谢物全局定量

对每个样品所有物质峰的强度进行箱线图和密度分布图展示,可以看到代谢物强度的中位数、动态范围等信息,也了解样品间分布的差异 。

 

图片说明:代谢物强度分布箱线图(Boxplot)。横坐标为每一个样品,纵坐标为该样品所有代谢物强度的分布,包括最小值,四分之一位点,中位数,四分之三位点,最大值等。不同颜色代表不同样品表型。
 

2.2 二级鉴定代谢物定量

对可信度较高的二级鉴定代谢物提取定量信息,单独展示,主要包括在所有生物样品中的强度分布、代谢物与代谢物之间的相关性。

图片说明:代谢物归一化强度boxplot图(示例图)。对每个二级鉴定代谢物的归一化强度在所有生物表型中进行展示。横坐标为样品组,纵坐标为归一化强度,每个点代表该代谢物在每一个样品的强度。
 

3 两两组别比较

代谢组学分析的主要目的是从检测到的大量代谢物中筛选出具有统计学和生物学意义的代谢物,并以此为基础阐明生物体的代谢过程和变化机制。由于代谢组学数据具有“高维、海量”的特点,因此需要用单维和多维的方法根据数据特性从不同角度进行分析。使用开源的MetaX代谢组学分析流程,可进行单变量和多变量分析,从而获得组间差异代谢物;其方法包括参数检验和非参数检验、差异表达倍数分析、主成分分析PCA、偏最小二乘法判别分析PLS-DA(>3样品)等。
 

3.1 差异统计

该项目采用单变量分析差异倍数(fold-change)和T统计检验得到的p-value值,来筛选差异表达的代谢物。差异离子同时满足:1)ratio >= 2 或者 ratio <= 1/2;最终差异离子如下图:
 

3.2 差异定量

差异代谢物定量质控包括火山图展示单变量分析、热图展示差异物质、PCA/PLSDA展示多变量分析。


图片说明:两组别点图(VolcanoPlot)。横、纵坐标分别为两表型强度值,可宏观评估差异代谢物的丰度分布。

 

3.3 二级鉴定差异代谢物

为了探索具体的差异代谢物以及其参与的生物途径,抽取可信度高的二级代谢物进行差异统计、差异定量和差异功能分析。



实验试剂列表